哈嘍,大家好~~~我是小編田甜，關(guān)于質(zhì)粒提取原理solution123，質(zhì)粒提取原理這個(gè)很多人還不知道,那么現(xiàn)在讓田甜帶著大家一起來看看吧！

1、堿裂解法： 溶液I的作用首先要控制好Tris-HCl溶液的pH和濃度；50 mM葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。

2、因此，如果溶液I中缺了葡萄糖實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。

3、在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的Ca2+和Mg2+等所有二價(jià)金屬離子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。

4、如果不加EDTA，也沒太大影響，只要是在不太長的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。

5、注意：菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。

6、 溶液II這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。

7、要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。

8、因?yàn)槠扑榧?xì)胞主要是堿的作用，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。

9、用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒；加SDS是為下一步操作做鋪墊。

10、這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過長，千萬不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。

11、 溶液III溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，因?yàn)槭榛蛩徕c（sodium dodecylsulfate，SDS）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。

12、溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。

13、而SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，同時(shí)大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。

14、因?yàn)榛蚪MDNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。

15、2 M的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA。

16、基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。

17、所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

18、溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。

19、 25/24/1的酚/氯仿/異戊醇PDS沉淀的形成并不能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。

20、用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇的原因：酚（Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

21、至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

22、 2倍體積的乙醇回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。

23、這時(shí)候如果放到－20℃，時(shí)間一長反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA酒精沉淀回收。

24、高濃度的鹽會(huì)水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。

25、如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。

26、得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果的。

27、 瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。

28、堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。

29、其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。

30、如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。

31、非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。

本文分享完畢，希望對(duì)大家有所幫助哦。

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